分光光度计简介

概述

分光光度计是在生物学,化学,临床和环境研究中广泛使用的仪器。

分光光度法是通过使用分光光度计使光束穿过样品的化学物质吸收量的定量测量。

通过测量检测到的光强度,该方法可用于确定样品中溶质的浓度。

分光光度法的概念

朝样品辐射的光束由光子流组成。

当光子遇到样品中的分子时,这些分子可能会吸收其中的一些分子,从而减少光束中光子的数量并降低检测到的信号的强度。

透射率是通过样品的光的比例,定义为通过样品的光的强度相对于入射光的强度。吸光度是透射率的倒数,是分光光度计要测量的数量。

根据吸光度,可以根据比尔-朗伯定律确定样品溶液的浓度,该定律指出,吸光度与样品浓度之间存在线性关系。根据比尔-兰伯特定律,吸光度是消光系数的乘积,消光系数是溶质吸收给定波长的光的强度,光穿过样品的长度或光程长度以及溶质浓度的量度。通常,进行吸光度测量的目的是测量样品的浓度。

分光光度计的组件

每个分光光度计都包括一个光源,一个准直仪(一个透镜或聚焦装置,可发射强烈的直光束),一个单色仪(用于将光束分成其组分波长)以及一个波长选择器(或狭缝),用于选择所需的波长。该视频中讨论的分光光度计中使用的光的波长在紫外线和可见光范围内。分光光度计还包括某种样品架,一个光电检测器(用于检测被吸收的光子数量)以及一个用于显示检测器输出的屏幕。

较新的分光光度计直接连接到计算机,可以控制实验参数并显示结果。

操作分光光度计

在进行分光光度法时,根据所使用的生物或化学溶液的类型,请务必采取适当的预防措施,例如戴上手套。

在测量样品的紫外线可见光谱之前,请打开机器,让灯和电子设备预热。

用相同的pH值和类似的离子强度制备空白溶液,但不加分析物的空白溶液;必要的步骤,因为电池和溶剂会散射一些光。

传统的分光光度计样品架设计用于容纳塑料和石英比色皿。继续将空白溶液移入比色杯中。

擦去所有指纹并从比色皿的外部溅出后,将比色皿正确插入样品架并关闭比色皿室的门。

切勿忘记关上门,因为打开的分光光度计发出的紫外线会损坏眼睛和皮肤。

设置要在样品上透射的所需波长或波长范围,这取决于分析物吸收的**佳光波长。然后,通过读取空白值将仪器归零,这将从样本缓冲区中减去背景。

根据要执行的分光光度实验的类型,可能有必要在样品测量之前生成标准曲线,从而**终确定样品分析物的浓度。

让样品达到合适的温度并轻轻混合,以免气泡进入。可以将样品直接添加到仪器内的比色杯中,并读取读数。

对样品进行吸光度测量后,进行适合实验的计算;例如确定浓度或酶活性速率。

应用

许多生物研究实验室每天都使用分光光度计。

分光光度计的一种常见应用是细胞密度的测量。细胞密度测量可用于生成细菌的对数生长曲线,从中可以确定诱导重组蛋白的**佳时间。

分光光度计还可用于测量化学反应速率。在该示例中,吸光度用于通过随时间在452 nm处反应中间体的消失来监测酶促反应。可以通过将数据拟合为适当的公式来计算该酶促步骤的速率。

**近,微体积分光光度计的推出消除了样品架的必要性。这种分光光度计利用表面张力来固定样品。

微体积光谱仪**适合用于测量有限体积的昂贵样品的质量和浓度,例如生物分子,包括蛋白质和核酸。

蛋白质在280 nm处的吸光度取决于色氨酸,酪氨酸和苯丙氨酸中芳族侧链的含量,以及半胱氨酸-半胱氨酸二硫键的存在。

可以从其在280 nm处的吸光度和消光系数(基于氨基酸组成)确定蛋白质浓度。

DNA和RNA在260 nm处都有一个**大吸光度,可以确定它们的浓度。核酸的纯度也可以根据特定波长下吸光度读数的比率进行评估。

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